复旦大学附属眼耳鼻科医院干眼中心洪佳旭：角膜病基因治疗研究进展｜嘉程创业流水席199席精彩回顾
12.08.2023 | 嘉程资本：创新者的第一笔钱 | 嘉程创业流水席
通过特洛伊木马策略，有效地将杀菌性的ASO递送到细菌体内，对于超级耐药菌或者不同细菌的混合感染，都显示出了良好的抗菌能力。
近日，嘉程创业流水席第199席【探讨新一代抗感染解决方案】，邀请了复旦大学附属眼耳鼻科医院干眼中心主任洪佳旭分享，主题是《角膜病基因治疗研究进展》
以下为正文部分：
我的课题组主要研究难治性的角膜病，包括细菌性角膜炎、超级细菌感染、病毒感染以及其他炎症性疾病。眼科虽然是一个小众的领域，但是眼科疾病并不是很多人所认为的对生活影响不大的疾病。正常人90%的外界信息是通过眼睛接收的，视觉质量对人们的生活至关重要。而另一方面，中国的盲人人数也是全球第二，仅次于印度，是一个非常庞大的人群。一直以来，我的课题组主要从事角膜病的生物治疗方面的研究，今天我想以细菌为主题，跟大家分享一下我们近期的工作，也希望能给大家带来一些启发。

眼部细菌耐药问题严重

谈到眼部的细菌感染，眼科的感染跟其他的全身感染有什么不同呢？眼科有一个便利的条件，就是眼睛是一个相对局限的器官，所以用滴眼液往往就能解决很多问题，不需要全身使用抗生素。但是另一方面，由于抗生素的滥用，目前耐药菌的出现比例也在逐渐升高。早在10年前，2013年我还是住院医师的时候，就做过一个研究，统计分析了过去20年在上海地区，特别是上海市五官科医院，对眼部感染细菌的药敏性的监测。我们发现，临床上要监测的细菌，特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）的比例逐年上升。对于医生而言，不仅仅是眼科医生，超级细菌的出现让我们感到非常棘手。因为对于这些患者，比如左上方C图所示的这种严重的快速的酮病毒菌的感染，它能够在一周之内使患者的角膜发生穿孔，而且这往往是一个严重的致盲性事件。如果大家还记得，将近20年之前有个宿州眼科事件，当时有一个白内障手术的消毒没有做到位，导致有集中的酮病毒菌的爆发，有9位患者眼球没有保住，也是很严重的一个细菌感染事件。
我这里要举一个发生在我们医院的真实案例，这是今年7月份的事情。这个患者在我们门诊出现了很快速的细菌感染，可以看到正常透明的角膜变得混浊。我们在第一时间就发现了这个情况，而且给予了很多抗生素的药物治疗。但很不幸的是，这个患者在5天的时间里就发生了角膜穿孔，眼睛的表面有严重的角膜溃疡。这个患者在我们医院进行了角膜移植，虽然保住了眼睛，但是可以想象的是，愈合后的视力会非常差，目前患者的视力也基本属于低视力的状态，对他的生活造成了很严重的影响。另一方面，这位患者又很不幸，他是一个独眼的患者。

抗菌治疗领域现状

所以，我们怎么能够在第一时间知道这个患者是细菌感染，特别是一些耐药细菌的感染，以及怎么能够有效地在第一时间控制呢？我们在抗生素之外的另一个选项，就是从纳米医学的角度寻找解决方案。我们一直在探索解决思路，寻找一些方法。之所以我们一开始会把这个方法投向纳米医学，也跟之前在靶向抗菌药物的整个领域的进展有关。因为基因编辑的酶本身也是起源于古老的细菌，另一方面也有研究用这种工程的毒素，或者是用抗菌肽的方式来做治疗，但是都面临各自的一些问题。
反义寡核苷酸（ASO）治疗策略引发关注
反义寡核苷酸（ASO）治疗策略近些年引起了科研院所和医生的关注，因为从广义的角度来看，它属于基因治疗的范畴。使用ASO治疗的原理非常简单，它是靶向特定细菌的一些生理性或功能性的基因，通过碱基互补配对的方式抑制转录，从而影响细菌的正常生存状态。
当然，ASO的这套策略的理想很丰满，现实很骨感，因为ASO在实际的临床应用中，存在几个问题：
  • 第一，ASO要想与它互补的基因结合，发挥抑制作用，必须能够有效地递送到细菌细胞内。而从细菌自身的进化选择的角度来说，如果对它是不利的、有毒的药物，它很可能就会进化出耐药的其他策略。
  • 第二，由于细菌有独特的质膜和细胞壁，无论是静电电荷还是尺寸的屏障，常规的ASO很难进入细菌细胞内。
  • 第三，我们很多人谈到这种创新疗法的时候，都会关注有效性的问题，即使你能够把ASO递送到细菌细胞中，如何能保证它不会引起哺乳动物细胞的非靶向生物毒性。

“特洛伊木马”治疗策略

我们的课题组与来自苏州大学的国家基金何耀教授的研究团队合作，他们提出了一种治疗策略，我们从眼科的角度进行应用。这种策略就是特洛伊木马的策略，特洛伊木马可能大家都非常熟悉，是一个古希腊神话，当时希腊人造了一个木马作为礼物，他们攻城的时候就把士兵藏在木马里面。利用这个方式偷偷地进入到城堡内，最后利用这些跑出来的士兵来攻陷城门，这其实就是我们在研究中所用到的一个策略。
简单来说，就是把一个对细菌有毒的反义寡核苷酸（ASO）片段，跟细菌的ATP酶的转运蛋白的物质结合在一起，利用合作方何耀教授的一个硅基片段，以三片段式的方式结合在一起。
我们在研究过程中所选定的木马如何伪装成一个细菌喜欢的东西，或者对细菌有诱惑力的东西，愿意把它放到细菌体内，我们是借用了一个ABC型的糖蛋白通道，ADP的转移酶通道。这个通道对于细菌是非常重要的，因为它是吸收环境中一些能量物质的重要通道。所以可想而知，如果这个蛋白发生突变，细菌在正常环境中它的生存是比较艰难的。我们的数据也很清晰，正是这样设计的一个纳米探针，能够被细菌有效地摄取进去。从图可以看出，当它进入到细菌体内的时候，可以表现出荧光。下面一个是多重耐药的大肠杆菌，下一个是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，可以看到它们都能把这个纳米颗粒有效地摄取到细菌体内。这就是我们所实现的第一步，用这样的一个东西可以通过硅基的方式进入细菌。与此同时，如果没有这样的一个特洛伊木马策略的纳米医学的纳米颗粒，它是不能实现荧光产生的。
为了验证我们设计的探针或者治疗性的纳米材料，能否被临床上比较常见的细菌摄入，无论是革兰氏阳性菌还是阴性菌，我们做了多种细菌的成像。我们选了几个比较有代表性的细菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿色假单胞菌等等。我们发现，它们在纳米颗粒上所结合的GP，就是糖基片段，对于细菌摄取环境中的营养物质，有很大的影响。GP的数目越多，细菌也越愿意把它当成一个食物摄入进去。当然，我们也发现GP数目有一个最优的值，当它在3～5个的时候，对于探针的摄入达到了顶峰。
下一步，我们还是回到问题本身，对于临床上治疗比较棘手的，或者没有太多治疗性抗生素滴眼液的细菌，有没有什么好的办法？我们从我们眼科样本提取到的耐药细菌，用这个治疗体系做了治疗，发现也起到了非常好的疗效。
我们还做了一个体外的模拟实验，把细菌和细胞混合在一起，然后加入探针，发现一个很有意思的现象。由于GP分子的存在，这样的探针只会被细菌特异性地吞噬，不会被细胞摄入。这是因为我们的细胞本身就没有这个通道，所以它是不可能被摄入进去的。但另一方面，我们也做了一个工程菌的改造，如果把ABC转运蛋白的通道突变掉，那么治疗性颗粒就不能进入到细菌的体内。
当然，更重要的是要在模型上验证它能不能实现这样的一个治疗。我们也在此之前做了一个安全性的测试，发现对于革兰氏阳性和阴性菌，这个探针不仅可以摄入，而且可以作为一个荧光探针，而且它的检测限很低，只要15个克隆单位，就能够发现。
我们也做了体外的抗菌性验证，发现耐药菌和基因改造菌都能够通过预期的ABC转运蛋白通道把它们摄入到细菌体内。但另一方面，如果用未经改造的普通菌做实验，发现它们也能够摄入这些探针，这说明对于普通的感染，不仅有抗生素可以治疗，也没有必要用到成本和价格都非常昂贵的ASO治疗策略。
我们还做了体外治疗的最低抑菌浓度和耐药突变率的测试，结果显示，我们构建的探针对于耐药细菌有更低的治疗性的抑制浓度，对于基因改造细菌有更高的耐药突变率，可以达到良好的治疗效果。
我们也在动物模型上进行了验证，在眼内炎和角膜炎的模型中都做了验证。为了观察这样的浓度在体内是如何起作用的，我们也做了药代的测试。可以看到，当药物的比例为25%的时候，持续作用时间是最长的。跟万古霉素相比，我们构建的探针可以用于不同细菌混合感染的有效治疗。
我们还做了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的混合感染的模型来证实，因为这种多重耐药或者多种细菌的混合感染，在临床上可能是真实存在的。其实，我们还是有办法设计不同的ASO片段，把它们加入我们的用药体系中。我们也做了比较多的丰满的动物实验来证实这个治疗体系在小鼠模型上的效果。
与此同时，我们也做了一些组织学的研究，发现不仅仅是单种细菌的感染，对于混合感染，我们的治疗体系也能够起到比较好的治疗效果。
所以我们的第一份工作是通过特洛伊木马策略，有效地将杀菌性的ASO递送到细菌体内，对于超级耐药菌或者不同细菌的混合感染，都显示出了良好的抗菌能力。同时，我们也能够高效地治疗细菌引起的眼内炎和角膜炎。

利用生物发光探针进行细菌诊断

既然我们能够治疗细菌感染，那么我们能不能用同样的方法来做细菌的诊断呢？答案肯定是肯定的。因为在真实的临床过程中，遇到细菌感染并不是我们所想象的那样，能够在第一时间就培养出来，因为有些细菌是比较特殊的。另一方面，细菌诊断，无论是培养还是其他方面，其实都是比较耗时的。这也是为什么我想到用这样一个荧光探针来做细菌的诊断。
我们利用类似的策略，通过一个生物发光探针，对细菌进行定向性的、指示性的诊断。原理是类似的，只是把治疗性的反义寡核苷酸（ASO）片段换成一个生物发光的探针。
结果也发现，由于我们是利用一个ABC型的酶的转运体，所以它对ATP的浓度有依赖性，跟ASO的结果是有些接近的。另一方面，我们也发现它的生物发光的时间在体内是比较长的，在两小时内都能取得比较好的治疗作用。
我们在体内做了穿透深度的测试，发现我们的探针在2.5公分的深度也能够有效地检测到它的亮度。我们的探针不仅仅适用于眼科表面的感染，因为眼科也有一些眼内的感染，从这个结果来看，我们的探针也能够应用于眼内的诊断和治疗。
我们还在体外做了多重耐药细菌的应用，可以看到不同的材料，敷在细菌上后的生物发光的现象。通过结构验证和对照组的比较，一个生物发光可以通过ABC转运蛋白通道进入细菌内部，而且有浓度依赖性，也是利用细菌内部的ATP实现生物发光。其实，底部细菌体内反倒也能用发光成像。我们证实，这样的一个生物发光探针可以靶向革兰氏阳性和阴性菌，而且革兰氏阳性菌和阴性菌对于不同的片段，都具有比较高的摄取率。
与此同时我们做了体表分析和流式，因为发光了就可以做流式分选。
当然，我们也做了验证性实验，如果把通道的基因敲除掉，我们发现，我们的探针就没办法进入到细菌体内，也通过另外一个实验来证实了ABC转运蛋白是探针的主要通道。
我们还通过实验来证实，这样的一个GP硅的BP是通过ABC转运的。通过糖原测试，我们发现，对于葡萄糖，它是一个比较好的能量介质。通过体外的共培养实验，我们证实，荧光碳只会特异性地靶向细菌，不会进入到哺乳动物细胞体内。
我们还通过来自我们眼科临床真实的样本做了验证。这10种细菌都是来自眼科临床，可以看到不同浓度的探针，以及临床细菌的样本，都能得到一个非常好的成像，证实这样一个探针具有比较低的检测限，小于10的六次方的CFU就能够实现检测。
通过这样的研究，也能够靶向临床上一些无菌的位置，例如眼睛内部，其实是不应该有细菌的。所以通过探测，如果看到有细菌，就能够第一时间知道这个部位发生了细菌性感染，比如细菌性眼内炎，这对于眼科临床是非常重要的。因为有一些眼内炎，虽然知道是病原体感染，但是具体是不是细菌，可能会决定后续的治疗方案，这对于早期快速诊断是非常有帮助的。另一方面，我们的探针也可以实现高灵敏度、高信噪比、高穿透性的深部成像，深度可达25毫米。从这点来说，我们的探针对于将来的临床应用是具有一定的应用场景的。
我希望通过这样的分享给大家带来更多的启示，恳请各位批评指正。谢谢。

Q&A

席友：在临床上眼部的感染很多抗生素使用没有效果的情况，你认为是耐药的问题，还是药物能不能渗透到感染部位的问题，会不会有这样一个难度？

洪佳旭：目前对于眼科所有主流的抗生素来说，它的渗透性都是非常好的，现在临床上主要用的是三代和四代的喹诺酮，这几个药其实已经有大量的药代能够证实它对于眼部的渗透是可以的。当然您提的问题，我觉得可以从两个维度来回答，第一，它能不能进到眼睛后面，答案是肯定可以的。第二，它进到后面的浓度，因为像这种喹诺酮类它的抑菌效果是浓度依赖的。所以如果确实是眼内炎的感染，有一些病人会推荐做眼内抗生素的注射，这样能够在局部达到比较高的浓度。但实际上所有的抗生素都能够在眼内达到基本的治疗浓度，有些真实的临床案例，如果细菌载量非常大，可能只有高浓度才有效。因为我们用过滴眼液的也能知道，点完药水几十秒内，一挤它就没了。所以能够进入到眼内的药物的剂量，以及它的浓度可能都是相对有限的，所以在临床上有一些眼内炎如果比较严重，第一时间还是建议做眼内的抗菌药的注射。
席友：像一个眼科医生是否需要常规的预防感染的措施，有没有可能做眼科的预防？

洪佳旭：我觉得做预防可能有一点过，而且我们一直在做，一般都是用常规的三羟喹诺酮、左氧氟沙星做预防。但我个人倒是觉得如果从真实的环境出发，你还要考虑价格和适用的普遍性，以及很多临床应用场景的考虑，我觉得多重耐药的切入点会更合适一些。  

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